1、主要懷疑點：洗板不充分：

1.1、機器洗版：確保機器設置的針頭能吸干孔中液體，并且加液針頭能加液大于350ul，加液針頭沒有被異物或者結晶鹽堵住。

1.2、手動洗板，嚴格按照步驟，使用干凈滅菌的槍頭和加樣槽，使用無氧化劑的吸水紙。加350ul洗液，靜置90秒，在吸水紙上拍干孔中液體后再加入下一步洗液或者試劑。

1.3、特別注意，在加入TMB前的洗板步驟極其重要，殘留的HRP酶會直接導致TMB顯色。

2、次要懷疑點：

2.1、TMB 已經污染，檢測TMB是否透明無色，如果偏藍就是污染了。

2.2、檢查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是雙蒸水，三蒸水或無離子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等過渡金屬，以及HClO都會氧化TMB。

2.3、酶標板受潮，長霉，或者試劑過期。

2.4、環境污染，空氣中有導致顯色的物質或者粉塵。